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为了确定局部照射对肿瘤生长和dscs的影响,当肿瘤直径达到75时,我们使用大分割r(20gy/f)治疗皮下llc肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周,在第7至第10天的最小体积约为5003,但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线,我们选择放疗后第3天为再生前生长,放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始,放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示,与未治疗的肿瘤相比,放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的cd11b特异性免疫组化染色显示,大多数炎症细胞是cd11b+髓系细胞,这表明局部照射可能导致dscs的积累。为了证实我们的假设,我们在局部照射后的不同时间点对总dscs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后,放疗后肿瘤浸润dscs的比例比未治疗肿瘤高2倍(crlvsr=2133±329vs4410±300,p<0001)。pn-dscs与总dscs具有相同的增加趋势(crlvsr=1637±247vs3866±424,p<0001),而-dsc比例保持在约01,且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。

为了确定受照射肿瘤中pn-dsc的逐渐积累是否有助于llc肿瘤的再生长,或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果,使用抗ly-6g单克隆抗体来消耗dsc抗ly-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中pn-dsc的频率(p<005)。此外,用抗ly-6g抗体治疗大大延迟了照射后的再生,这表明pn-dsc的募集对肿瘤再生至关重要。

虽然pn-dscs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应,这涉及到许多免疫细胞和细胞因子,但对cd8+细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定r后pn-dscs诱导的免疫抑制是否依赖于cd8+细胞,我们通过流式细胞术评估了cd8+细胞的数量和功能。

如图3d所示,cd8+细胞的百分比随着照射从1171±231下降到242±062(p<001)。pn-dsc耗竭逆转了这种下降(r+ani-ly-6g抗体=242±062vs2012±392,p<001)。为了更好地了解cd8+细胞浸润肿瘤部位的功能状态,我们测量了cd8+细胞内部和表面上ifn-γ、cd28和pd-1的表达。局部r显着降低了cd8+细胞分泌ifn-γ的比例,从3306453降至1325208,并增加了表达pd-1的cd8+细胞的比例(crlvsr=25320±5703auvs53880±9876)au,p<005)。

cd28表达未观察到显着变化。当抗ly-6g抗体被给予辐照小鼠时,ifn-γ分泌达到与未处理的llc小鼠相同的水平(2974±355),而与辐照小鼠进行比较抗ly-6g抗体处理后的pd-1表达没有变化小鼠。因此,在这部分我们建议pn-dscs通过抑制cd8+细胞促进放疗后肿瘤的再生。pn-dscs不仅抑制了中cd8+细胞的数量,而且还抑制了其活性。

为了确定辐照诱导dscs的抑制机制,我们进行了免疫组化染色及1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示,局部r增强了arg1的表达,但没有增强os的表达。arg1活性测定表明,局部照射显著提高了arg1的活性,从040015u/l提高到378039u/l((p<001)。相比之下,no荧光标记的os活性检测显示,辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。

pd-l1的表达是dscs的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-l1上调是否是r后dscs介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后dsc中pd-l1的表达。图4e显示,与未处理组相比,受照射肿瘤的dsc中的pd-l1表达在照射后不久显着增加(照射后第三天crlvsr=4439±1753auvs13280±3243au,p<005)然而,此后pd-l1表达继续下降,局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组(crlvsr=1,4650±3996auvs4075±1648au,p<005)。外周血中dscs的pd-l1表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。

以上数据表明arg1表达的上调是照射后pn-dscs抑制功能的合理机制。然而,不涉及pd-l1和os的调节。为了进一步证实这一假设,在辐射后通过灌胃给予arg1抑制剂nor-noha。10g/kg/dnor-noha有效地将arg1活性从378039u/l降低到202025u/l(p<001)。

r后给予nor-noha显着增加cd8+细胞比例(rvsr+nor-noha=242062vs614064,p<001),并伴有肿瘤再生延迟。os抑制剂1400对肿瘤再生长没有影响。

我们的结果表明,r通过上调肿瘤内pn-dsc的百分比和arg1活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制pn-dscs及其arg1活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明,pde5抑制剂可以抑制b小鼠和癌症患者dsc中1的活性和表达。因此,通过灌胃给予西地那非20g/kg/d,以研究它是否可以促进r的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b所示,正如我们预期的那样,西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长,这与阳性对照nor-noha相当。的免疫特征表明,当给予西地那非时,肿瘤内pn-dsc的比例从3866±424下降到57±238。

此外,西地那非也显着降低了arg1的表达。为了进一步检查西地那非对dsc的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强,我们分析了肿瘤内cd8+细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明cd8+细胞的百分比从242±062增加到721±122。

此外,当给予西地那非时,cd8+细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此,我们证实pde5抑制剂西地那非通过调节pn-dscs改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。

工作揭示了pn-dscs中arg1通路介导r后肿瘤再生的新机制,如图6所示。我们认为,pn-dscs是辐照招募的主要亚型,而不是-dscs。在广泛的免疫抑制机制中,arg1的上调和激活是pn-dscs在放疗后抑制cd8+细胞的主要机制。为了克服pn-dscs引起的免疫抑制,我们提出并证明,sildenafil和r联合使用降低了pn-dscs在内的募集和免疫抑制作用,激活了cd8+细胞应答,导致肿瘤生长延迟。综上所述,我们的研究结果为缓解免疫抑制以提高r治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在llc小鼠模型中进行的,但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外,在不同的辐射方案下,dscs及其亚型如何影响仍未确定。因此,这些问题还需要进一步的研究来解决。

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